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前  言

小鼠大腦在自然環(huán)境中的無創(chuàng)成像對于研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能和疾病進(jìn)展至關(guān)重要。但在活體狀態(tài)下,大腦有顱骨覆蓋,而顱骨對光的強(qiáng)散射和像差嚴(yán)重限制了光的穿透深度,進(jìn)而影響了皮層成像的分辨率和深度。以往的解決辦法是進(jìn)行各類手術(shù)構(gòu)建顱窗,主要包括磨薄顱骨窗、開顱玻璃窗等。磨薄顱骨窗是將部分顱骨磨薄至約25 μm左右,雖然這樣顱骨不會過多地限制光的穿透,可以實(shí)現(xiàn)對皮層的活體高分辨觀測。但磨薄顱骨窗不適用于大視場觀測皮層,因?yàn)閷⒋竺娣e的顱骨均勻地磨薄至25 μm非常困難。另外,顱骨被磨薄后會重新生長,并且新生的顱骨質(zhì)地會發(fā)生變化、易碎,成像質(zhì)量會隨著反復(fù)磨薄越來越差、且難以實(shí)現(xiàn)多次的重復(fù)打磨。所以,磨薄顱骨窗不適用于長期跟蹤觀測。而開顱手術(shù)容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng),且大多會有較長的術(shù)后期,不適合對急性模型的觀測。此外,侵入性的顱骨開窗手術(shù)還可導(dǎo)致多種生理反應(yīng),如小膠質(zhì)細(xì)胞激活、顱壓和腦脊液損失等,會對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生負(fù)面影響。

相比之下,非侵入性的顱骨透明技術(shù)可通過完整的顱骨成像為活體狀態(tài)下的大腦監(jiān)測提供了另一種方法。研究人員曾使用生物相容性試劑使顱骨本身透明,目的是為光學(xué)成像提供一個(gè)大窗口,而無需開顱手術(shù)或磨薄顱骨。然而,過去開發(fā)的技術(shù)不能提供長期觀察的穩(wěn)定窗口或高度透明的顱骨。近年興起的組織光透明技術(shù)可以降低生物組織的散射,增強(qiáng)光在組織中的穿透能力,已被廣泛應(yīng)用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像。不僅如此,組織光透明技術(shù)在活體水平也得到了很好的應(yīng)用,可以在不進(jìn)行開顱手術(shù)的情況下,結(jié)合多種現(xiàn)代光學(xué)成像手段,實(shí)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能的觀測。光透明顱窗這種另類“腦洞大開”的技術(shù)可以避免手術(shù)帶來的炎癥反應(yīng),從而適用于急性觀測。也可以通過反復(fù)操作觀測數(shù)月,從而實(shí)現(xiàn)長期跟蹤監(jiān)測。本文對幾種活體顱骨光透明技術(shù)進(jìn)行簡要的介紹。

TIS(光透明顱骨窗)應(yīng)用于小鼠腦結(jié)構(gòu)和功能的成像。通過完整顱骨窗口,可以在數(shù)周內(nèi)保持大面積的小鼠顱骨透明,以便進(jìn)行高分辨率光學(xué)成像。

常用的活體顱骨光透明技術(shù)

和皮膚等軟組織不同,顱骨的主要成分包括羥基磷灰石(鈣質(zhì))、膠原蛋白(16%)、脂質(zhì)(54%)和水(14%)。因此,活體顱骨光透明的基本原理就是部分去除顱骨中的鈣質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì),并用折射率匹配液進(jìn)一步提高透明效果。目前主要的活體顱骨光透明技術(shù)有以下幾種:

為了去除顱骨中的散射子,研究人員發(fā)明了一種顱骨光透明液(Skull Optical Clearing Solution,SOCS),它是一種包含EDTA,DMSO、山梨醇、月桂醇、乙醇、葡萄糖的弱堿性溶液。在實(shí)驗(yàn)過程中,首先將小鼠的頭皮剪開,暴露顱骨,然后將顱骨用SOCS 孵育25 min ,即可讓混濁的顱骨變得透明,皮層微血管也逐漸從不可見變得清晰可見。這種方法能夠分辨的最小血管直徑為(14.4±0.8)μm,而在開顱狀態(tài)下可分辨的最小血管直徑為(12.8±0.9)μm,證明顱骨透明化的成像效果接近于開顱狀態(tài)。SOCS 可以提高激光散斑成像的質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)皮層血流分布可視化。

從完整頭骨(a)獲得的典型白光圖像,SOCS處理25分鐘后透明顱骨,不暴露(b)和暴露出矩形區(qū)域A(c)的皮層。(d) 、(e)和(f)是(a)、(b)和(c)矩形區(qū)域A的相應(yīng)放大圖。

研究人員開發(fā)出一種優(yōu)化的顱骨光透明窗(Skull Optical Clearing Window,SOCW),結(jié)合雙光子熒光顯微鏡可以獲得達(dá)到突觸級別的成像分辨率。顱骨中的無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的主要成分分別是羥基磷灰石鈣和膠原蛋白,隨著小鼠年齡的增長,無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的比例也會發(fā)生變化。因此,針對不同周齡的小鼠,研究人員開發(fā)了不同的顱骨清除方法以建立光透明窗。SOCW 的建立步驟分為兩步:首先,對于出生15~20天的小鼠,用10%的膠原酶溶液局部孵育完整顱骨5~10 min;對于出生21~30天的小鼠,將膠原酶溶液置換為10%的EDTA 二鈉溶液,同樣孵育5~10 min;對于出生超過30天的小鼠,顱骨生長得更厚,因此需要先將顱骨磨薄至約100 μm,然后用10%的EDTA 二鈉溶液孵育5~10 min。進(jìn)一步,將80%的甘油滴加在顱骨上,進(jìn)行折射率匹配,即完成了光透明顱窗的建立。利用雙光子熒光顯微鏡,可以透過SOCW 實(shí)現(xiàn)對皮層20~80 μm 深處的神經(jīng)元樹突棘的觀測。但是,該方法用于4 周齡以上的小鼠時(shí)需要對顱骨進(jìn)行打磨,不僅增加了實(shí)驗(yàn)難度,還會遇到與磨薄顱骨窗同樣的問題,即難以實(shí)現(xiàn)大視場的觀測以及長期重復(fù)觀測。

SOCW皮層成像技術(shù)示意圖

2018年,研究人員開發(fā)了一種基于尿素的光透明方法(Urea-based Skull Optical Clearing Agent,USOCA),成功解決SOCW 未能解決的兩大難題,即視場較小和無法實(shí)現(xiàn)長期跟蹤。USOCA 包含兩種混和試劑,第一種S1是75% 乙醇溶解的飽和尿素溶液,乙醇溶液與尿素的體積-質(zhì)量比約為10∶3 mL/g。乙醇分子上的羥基可以促使膠原解離,而尿素不僅因其有水合作用而被廣泛用于組織透明化,還可以起到促滲的作用。另一種S2是高濃度的十二烷基苯磺酸鈉(Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate,SDBS)溶液,它是由0.7 mol/L的氫氧化鈉溶液與十二烷基苯磺酸配置而成的,前者與后者的體積-質(zhì)量比約為24∶5 mL/g,且pH 值保持在7.2~8 的范圍內(nèi)。十二烷基苯磺酸鈉是一種離子型去垢劑,有去脂作用,可以使得顱骨成分更加均一。剪開小鼠頭皮、暴露顱骨后,將第一種試劑S1滴加在顱骨,其間用鑷子夾住小棉球不斷在顱骨上擦拭以進(jìn)行物理促滲,顱骨會慢慢變透明。10 min后擦除S1,將第二種試劑S2滴加在顱骨上,并孵育5 min,在這段時(shí)間內(nèi),顱骨會很快變得更為透明。由于完全不需要對顱骨進(jìn)行磨薄處理,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整光透明顱窗的尺寸。實(shí)驗(yàn)人員利用USOCA 對缺血性腦卒中及再灌注過程進(jìn)行了雙側(cè)大腦皮層的血流成像。待成像完成后,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS)將光透明試劑清洗干凈,顱骨即可恢復(fù)至原有狀態(tài),即“關(guān)閉”光透明顱窗。若需要進(jìn)行重復(fù)成像,只需再進(jìn)行透明操作即可再次“打開”光透明顱窗。USOCA 可以適用于2~8 月齡的小鼠,這一特性與大視場和可長期重復(fù)“開合”的特性,極大地拓展了活體顱骨光透明技術(shù)的應(yīng)用范圍。但是,USOCA 結(jié)合雙光子熒光顯微術(shù),也僅能獲得皮層300 μm 的成像深度,這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到小鼠皮層的厚度(>1 mm)。因此光透明顱窗的透明度還有待進(jìn)一步提升,來滿足深皮層成像的需求。

USOCA的制備和實(shí)驗(yàn)程序。(A) USOCA照片。(B) S1和S2的制備步驟。(C)實(shí)驗(yàn)步驟。

為了進(jìn)一步提高光透明顱窗的透明度,研究人員將SOCW 和USOCA 兩種顱骨光透明方法進(jìn)行結(jié)合。他們利用非標(biāo)記的高光譜受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering,SRS)顯微術(shù)對兩種顱骨光透明方法的分子機(jī)制進(jìn)行了闡釋。SRS 可以將光透明劑對顱骨不同成分的影響進(jìn)行可視化。SOCW 的主要成分是膠原酶和EDTA。10% 的膠原酶孵育5~10 min 后,顱骨表面的膠原纖維能得到有效解聚。但膠原酶不能降解羥基磷灰石和羥基磷灰石內(nèi)部的膠原。相反,EDTA 孵育5~10 min后,骨陷窩周圍形成大量空腔,顱骨內(nèi)羥基磷灰石的厚度明顯降低。這意味著EDTA不僅能分解羥基磷灰石,還能使蛋白質(zhì)均質(zhì)化。USOCA的主要有效成分是尿素的75%乙醇溶液和十二烷基苯磺酸鈉溶液。USOCA 孵育15 min 后,顱骨表面和深層區(qū)域的蛋白均被解聚并重新均勻分布。與膠原酶相比,USOCA 具有更強(qiáng)的溶解蛋白質(zhì)的能力。科研人員依次用USOCA(25 min)、10% 的EDTA(25 min)對顱骨進(jìn)行孵育,去除后滴加80% 的甘油并進(jìn)行成像,可以得到非常顯著的透明效果。結(jié)合三光子熒光顯微鏡,可以對皮層850 μm 深的血管進(jìn)行成像觀測。將SOCW 和USOCA 進(jìn)行結(jié)合,進(jìn)一步拓展了光透明顱窗下的成像深度。但是,結(jié)合兩種方法,使得光透明顱窗的建立時(shí)間接近一個(gè)小時(shí),降低了便捷性。另一方面,同時(shí)去除了顱骨中的膠原蛋白和羥基磷灰石,可能使得顱骨的剛性結(jié)構(gòu)、以及它對大腦的保護(hù)作用受到影響,不利于長期跟蹤觀測。

顱骨光學(xué)透明過程的3D 拉曼散射圖像。(a-c)18日齡小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的顯微結(jié)構(gòu)圖像。顱骨未經(jīng)處理(a),用10%膠原酶處理5-10分鐘(b),然后用10%EDTA處理5-30分鐘(c)。(d-f)2月齡小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的微觀結(jié)構(gòu)變化。治療前的骨骼(d),USOCA治療15分鐘(e),然后在另一塊骨骼上使用10%EDTA治療5-10分鐘(f)。頭蓋骨來自頭骨的頂骨區(qū)域,在圖f中用黑色方框表示。標(biāo)尺,30 μm。

顱骨光透明技術(shù)主要著眼于減低顱骨的散射,這對于利用可見光和近紅外Ⅰ區(qū)(700~900 nm)波段的成像非常重要。但是,在近紅外Ⅱ區(qū)(900/1000~1700 nm),生物組織的散射減少,吸收就是另一個(gè)需要考慮的重要因素。研究人員測量了USOCA 方法所用的兩種混和試劑的透過率,發(fā)現(xiàn)在近紅外Ⅱ區(qū)、尤其在1300 nm以上的波段有著非常大的吸收,這對于近紅外Ⅱ區(qū)成像顯然非常不利。該吸收主要是光透明試劑中的重要成分水(H2O)帶來的。為了克服這一問題,研究人員將水替換成在可見光到近紅外Ⅱ區(qū)均有較高透過率的重水(D2O),并將以此配置的顱骨光透明試劑命名為適用于可見-近紅外Ⅱ區(qū)的顱骨光透明試劑(Visible-Near infrared Ⅱ-compatible Skull Optical Clearing Agent,VNSOCA)。研究人員首先用體外成像實(shí)驗(yàn)比較了USOCA 和VNSOCA 對近紅外二區(qū)激發(fā)的非線性光學(xué)成像的適用性,將一種三倍頻探針的溶液放置在毛細(xì)玻璃管中,將其放置在1560 nm飛秒激光激發(fā)的三倍頻顯微鏡下,分別將USOCA 和VNSOCA 作為成像介質(zhì)進(jìn)行成像。結(jié)果表明,由于USOCA 對激發(fā)光有較大的吸收,限制了整套成像方案的效率,因而探測到的三倍頻信號非常有限。相對的,VNSOCA 作為成像介質(zhì)時(shí),測得的信號強(qiáng)度提升了3 倍以上。后續(xù)活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,即使基于利用近紅外二區(qū)(1560 nm)激發(fā)的三倍頻成像技術(shù),也只能在渾濁顱骨下獲取皮層200 μm 深的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu),而VNSOCA 建立的光透明顱窗,可以將穿顱血管成像深度提升3 倍以上。VNSCOA 的發(fā)明,為顱骨光透明技術(shù)在近紅外Ⅱ區(qū)成像領(lǐng)域的應(yīng)用提供了方法,拓展了光透明顱窗適用的波段范圍。

A和B,光學(xué)透明劑(VNSOCA)處理前后的顱骨皮層血管可見-近紅外兼容的光透明的典型白場圖像。C和D,在顱骨透明前后用×5掃描透鏡采集的典型大視場三倍頻(THG)成像。

展   望

活體顱骨光透明技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域,如神經(jīng)血管成像、皮層光操控、建立特定的疾病模型等,為活體皮層觀測提供了一個(gè)無需開顱的光學(xué)窗口。不同的腦科學(xué)研究對顱窗的要求不同。比如,神經(jīng)突觸成像需要高分辨觀測,許多疾病的研究需要長時(shí)程跟蹤,急性病理模型需要建窗口立即觀測,神經(jīng)功能成像需要在清醒動物上開展,跨腦區(qū)研究需要較大的觀測視場。而光透明顱窗發(fā)展至今,已同時(shí)具備了高分辨、大視場、長時(shí)程、適用于急性觀測的優(yōu)勢,因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無法勝任的場合(比如急性創(chuàng)傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測)提供重要的技術(shù)支撐,從而在未來的腦科學(xué)研究中大放異彩。但是,仍舊要意識到目前顱骨光透明技術(shù)依然有所限制。比如,目前尚未有適用于更大動物(比如大鼠、獼猴等)的活體顱骨光透明方法,這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。未來更好的顱骨光透明的出現(xiàn),結(jié)合更多的成像方法,會為腦科學(xué)的發(fā)展提供更有力的技術(shù)保障。

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文案 | 靈犀

排版 | 周琦 李海月

審核 | Jane 劉澤鵬