| 疫情之下，單克隆抗體能做什么？ |
探索為什么單克隆抗體（mAbs）在對抗新型冠狀病毒的戰(zhàn)斗中至關(guān)重要，以及疫情如何影響了它們的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)渠道。 三年來，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）治療藥物研發(fā)取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，疫苗接種一直處于抗疫的最前線。通過mRNA，疫苗促使你的細(xì)胞產(chǎn)生無害的刺突（Spike）蛋白，從而刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體來抵御潛在的威脅。而當(dāng)前的問題是如果你已經(jīng)感染了COVID-19，或者你的免疫系統(tǒng)受到損害，即使接種了疫苗也會(huì)有很高的住院風(fēng)險(xiǎn)。這就是需要單克隆抗體發(fā)揮作用的時(shí)候，在病毒侵入人體后，它可以靶向中和病毒。 為什么單克隆抗體對SARS-CoV-2有效? 單克隆抗體通過病毒中和作用來作用于病毒，它們之所以有效，是因?yàn)樗鼈冎袛嗔瞬《咀R(shí)別宿主或內(nèi)化病毒的過程。 單克隆抗體的作用機(jī)制 在SARS-CoV-2中，單克隆抗體目的是破壞Spike蛋白與ACE2受體的結(jié)合，阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，Spike蛋白通過其結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)介導(dǎo)結(jié)合，目前大多數(shù)中和性單克隆抗體都是針對RBD而產(chǎn)生。 對抗COVID-19變體，單克隆抗體的有效性如何？ 在有效性方面，由于變體的數(shù)量不斷增加，很難給出一個(gè)單一的答案。不同變體的療效不同，例如，盡管大多數(shù)緊急使用授權(quán)抗體對α和δ變體有效，但對Omicron變體的療效較低。 Omicron面臨的挑戰(zhàn)是Spike蛋白上至少有36個(gè)突變，其中一些位于RBD。這些突變導(dǎo)致差異糖基化，使病毒能夠避開先前形成的免疫應(yīng)答或單克隆抗體中和。 幸運(yùn)的是，較新的抗體如Sotrovimab，在最近的變體中設(shè)法保留了它們的中和活性，所以仍然有一線希望，然而療效可能會(huì)有很大差異，一些抗體對α和β變體非常有效，但對γ或δ變體無效。相比之下，對δ和α有效的抗體對β、γ和Omicron變體的效果要差得多。特定變異突變對EC50的影響取決于突變是否位于結(jié)合表位。
單克隆抗體優(yōu)于其他新冠肺炎療法的優(yōu)勢 確定劑量水平是單克隆抗體在新冠肺炎治療中的主要優(yōu)勢之一。 根據(jù)Madasu博士的說法，恢復(fù)期血漿療法的成功率在很大程度上取決于捐贈(zèng)者。Madasu進(jìn)一步解釋說：“在恢復(fù)期血漿療法中，A)你期望供體仍能產(chǎn)生中和抗體，B)供體產(chǎn)生的量足以有效。使用單克隆抗體，我們可以準(zhǔn)確地知道我們給病人注射了多少中和抗體，這是一個(gè)巨大的優(yōu)勢�！� 恢復(fù)期血漿治療會(huì)存在患者血漿不相容的重大風(fēng)險(xiǎn)，使用單克隆抗體作為有效的新冠肺炎治療方法可顯著降低這些風(fēng)險(xiǎn)。 Mitchell博士強(qiáng)調(diào)了單克隆抗體治療的另一個(gè)值得注意的特點(diǎn)，即能夠產(chǎn)生一種假多克隆混合物亞群，這種混合物可以中和任何未來可能出現(xiàn)的變體。有人可能會(huì)問：我們怎么能如此肯定這些抗體會(huì)對未來的變體有效？由于每個(gè)亞群都有特定的結(jié)合表位，因此突變可以被一個(gè)或多個(gè)mAb亞群快速識(shí)別。 Mitchell博士舉例道：“五年后，如果一種新型變異體出現(xiàn)，我們可能能夠使用針對2023年出現(xiàn)的野生型PLUS的單克隆抗體作為聯(lián)合療法，對這種特殊變異體產(chǎn)生更大的療效�！� 新冠疫情大流行的影響 目前單克隆抗體技術(shù)一直在發(fā)展中，而如果沒有新冠疫情，單克隆抗體生產(chǎn)的技術(shù)仍會(huì)取得進(jìn)步嗎？ 盡管已經(jīng)建立了單克隆抗體的研發(fā)過程，但疫情仍會(huì)給與我們一種緊迫感。Madasu博士還認(rèn)為，與疫苗相比，人們對抗體療法的理解更容易/更好。在疫情的早期階段因?qū)σ呙绲挠行圆皇呛芰私�，因此有些人可能對接種疫苗猶豫不決。另一方面，人們對抗體有了更深的理解，因此基于抗體的療法被更廣泛地接受。 疫情不僅加速了現(xiàn)有策略的改進(jìn)，還促進(jìn)了新技術(shù)的發(fā)展。諸如高通量表面等離子體共振(SPR)、高通量生物層干涉測量(BLI)等技術(shù)在疫情期間引起了人們的興趣。此外，高通量動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和FLD也有很大的進(jìn)步。而較新的技術(shù)之一是基于人工智能的De Novo單克隆抗體設(shè)計(jì)，它提高了抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的速度和復(fù)雜性。 COVID-19單克隆抗體工作流程 構(gòu)建工作流程的第一步是選擇用于開發(fā)單克隆抗體的抗原。在初始階段，免疫是通過將抗原給藥于產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動(dòng)物而發(fā)生的。然后分離動(dòng)物免疫反應(yīng)期間產(chǎn)生的B細(xì)胞，接著與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。 根據(jù)Mitchell博士的說法，成功的初始階段的關(guān)鍵是抗原的優(yōu)化�！霸谛鹿诜窝椎那闆r下，抗體主要針對刺突蛋白，這是一種三聚體。刺突蛋白具有形成高分子量聚集體的傾向，這對于免疫策略可能不是很好”。 此外，刺突蛋白的糖基化模式在不同細(xì)胞類型之間差異很大，更不用說不同物種了。 這就是為什么我們必須非常小心地選擇抗原。即使單個(gè)抗原聚糖(例如在不同的變體中)的輕微偏差也會(huì)顯著影響抗體的成功率。
挑戰(zhàn)和瓶頸 免疫接種 目前一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是對病毒基因組的了解，研究團(tuán)隊(duì)通常必須合成和純化抗原，并優(yōu)化它們的表達(dá)。然而，為了評估表達(dá)和純化的成功程度，他們不得不依靠科學(xué)家的合作來發(fā)布來自他們自己實(shí)驗(yàn)室的信息�？偟膩碚f，動(dòng)物的免疫和雜交瘤的產(chǎn)生可能需要長達(dá)8周的時(shí)間。 單細(xì)胞分離 在確定免疫策略的最佳質(zhì)量抗原后，下一個(gè)挑戰(zhàn)是獲得足夠數(shù)量的B細(xì)胞以進(jìn)行雜交瘤的單細(xì)胞分離。 培養(yǎng)這些雜交瘤的傳統(tǒng)方法是使用半固體培養(yǎng)基，使單細(xì)胞形成克隆。這過去是一個(gè)緩慢的過程，但后來隨著自動(dòng)化儀器的出現(xiàn)，這一過程得到了發(fā)展，自動(dòng)化儀器允許在微孔板的每個(gè)孔中打印單個(gè)細(xì)胞，從而提高了產(chǎn)量和效率。 需要注意的是，先進(jìn)的單細(xì)胞分離工具還可提高克隆生長效率，并可驗(yàn)證克隆是否來自單細(xì)胞。 大規(guī)模單克隆性 對于大規(guī)模單克隆性，需要產(chǎn)生重組形式的單細(xì)胞分離雜交瘤，因?yàn)閱渭?xì)胞分離不足以產(chǎn)生臨床相關(guān)的mAb。臨床試驗(yàn)的批準(zhǔn)將需要重組產(chǎn)生單克隆抗體，將其制成可產(chǎn)生適當(dāng)免疫反應(yīng)的人抗體。 為了形成穩(wěn)定的細(xì)胞系以產(chǎn)生足夠濃度的單克隆抗體，您需要對基因進(jìn)行測序和改造，使其成為人類構(gòu)建體。使用CHO細(xì)胞系進(jìn)行重組產(chǎn)生，目的是產(chǎn)生8-20 g/L的mAb。
時(shí)間和資金限制 時(shí)間和成本是mAb工作流中需要考慮的關(guān)鍵因素 雖然穩(wěn)定克隆的產(chǎn)生可以在最初培養(yǎng)后12天內(nèi)實(shí)現(xiàn)，但是用傳統(tǒng)的克隆方法，完全的單克隆保證可能需要長達(dá)6個(gè)月。更重要的是，生產(chǎn)一個(gè)完全實(shí)現(xiàn)的mAb結(jié)構(gòu)可能是昂貴的。解決辦法是形成單鏈可變片段抗體或VHH納米抗體，這些是可能表現(xiàn)出對抗原的特異性結(jié)合親和力的最小抗體片段，Mitchell博士總結(jié)了這種方法如此強(qiáng)大的原因: “通過將單克隆抗體轉(zhuǎn)化為更小的納米抗體，我們可以在大腸桿菌中以更具成本效益的方式生產(chǎn)它們。這降低了成本從而使其成為一種廣泛適用的療法，而不是那些只有在發(fā)達(dá)國家才能獲得的療法�！� 根據(jù)Madasu博士的說法，它們穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得向發(fā)展中國家的分銷更加容易�！拔覀冃枰紤]其他無法獲得存儲(chǔ)設(shè)施的發(fā)展中國家。其中一些納米抗體非常穩(wěn)定，可以在不太嚴(yán)格的條件下儲(chǔ)存�！� 顯然，抗體到納米抗體的轉(zhuǎn)化是以較低成本在全球推廣基于單克隆抗體的療法的關(guān)鍵一步。尤其是在儲(chǔ)存設(shè)施不足的發(fā)展中國家，納米體在極端溫度下仍能保持穩(wěn)定。 確保單克隆性，自動(dòng)化加速COVID-19單抗的生產(chǎn) 單克隆性保證 確保大規(guī)模單克隆的方法包括單細(xì)胞打印或克隆采集等自動(dòng)化技術(shù)。當(dāng)從HAT培養(yǎng)基中挑選一個(gè)單克隆時(shí)，該儀器在挑選克隆后從第0天開始的一段時(shí)間內(nèi)拍攝圖像，拍攝的圖片可成為單克隆性的證據(jù)。為了確保高性能克隆，實(shí)驗(yàn)室可以使用基于細(xì)胞或基于免疫的檢測結(jié)合基于圖像的方法。這種組合策略可確保您的克隆具有單克隆性，并且正在分泌單一種類的抗體。作為該過程的最后一步，進(jìn)行表位結(jié)合實(shí)驗(yàn)也有助于判斷表位結(jié)合是否均勻。
自動(dòng)化的作用 縮短開發(fā)時(shí)間的最終方法是實(shí)現(xiàn)高通量的自動(dòng)化儀器來驗(yàn)證克隆。在新冠肺炎的自動(dòng)化mAb工作流程中，自動(dòng)化純化為了解克隆的行為以及單克隆抗體生成高分子量聚集體的可能性提供了很大的幫助。 用自動(dòng)化儀器實(shí)現(xiàn)高通量一直是將新療法推向市場的優(yōu)勢。這種方法能更好的概述蛋白質(zhì)空間或表位空間。擁有大量的克隆可以最大限度地增加獲得覆蓋所有所需屬性的單克隆抗體的機(jī)會(huì)，而不是只有一個(gè)覆蓋部分抗原的單克隆抗體。 通過高通量工作流，可以將關(guān)注點(diǎn)縮小到產(chǎn)量最高的單克隆亞群。然后，您可以繼續(xù)使用排名最高的亞群進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物研究和毒理學(xué)測試評估。您還可以通過消除不適合大規(guī)模純化的亞群來節(jié)省時(shí)間，這可以防止實(shí)驗(yàn)室新冠肺炎研究期間的資金流失。 未來單克隆抗體實(shí)驗(yàn)室流程的自動(dòng)化 許多新冠肺炎研究實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化過程，因?yàn)樗麄兠恐苣軌蛏蓴?shù)千個(gè)克隆的數(shù)據(jù)。自動(dòng)化合成、表達(dá)、純化和生物物理表征更有可能理解單克隆抗體的治療機(jī)制。 更重要的是，自動(dòng)化為無偏見的分析方法和選擇標(biāo)準(zhǔn)鋪平了道路�？陀^分析對于使抗體庫多樣化以用于廣泛的變體和突變是必要的，以避免擴(kuò)大只能治療一小部分變異的抗體。
SARS-CoV-2的研究前景及單克隆抗體的作用
自1986年以來，基于單克隆抗體的療法已在美國市場上市，F(xiàn)DA首次批準(zhǔn)開發(fā)單克隆抗體，以減少器官移植患者的急性排斥反應(yīng)。(1)當(dāng)前的新冠肺炎研究也增加了單克隆抗體在診斷學(xué)中的重要性。事實(shí)上，單克隆抗體在檢測新型冠狀病毒變異中發(fā)揮了重要作用。
除了診斷之外，目前的單克隆抗體有助于研究人員確定必要的修飾，甚至為候選疫苗的開發(fā)提供信息。在研究參考單克隆抗體是否可以中和病毒變異體時(shí)，研究人員可以決定是否開發(fā)更有效的新療法。 雖然基于mRNA的疫苗一直是抗擊新冠肺炎的核心，但單克隆抗體一直在推動(dòng)各種應(yīng)用的發(fā)展，從基于蛋白質(zhì)的疫苗到基于抗體的治療。 Madasu博士和Mitchell博士認(rèn)為，未來單克隆抗體可以特別地應(yīng)用于未接種疫苗的人群，包括嬰兒、并發(fā)癥患者(對疫苗反應(yīng)不佳)和猶豫是否接種疫苗的人。如前所述，關(guān)鍵是通過提高發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)過程的效率，生產(chǎn)出具有成本效益的基于單克隆抗體的療法，并使它們盡可能廣泛地使用。
使用Molecular Devices的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化解決方案開發(fā)COVID-19單克隆抗體 克隆篩選是單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的瓶頸之一，因?yàn)槟仨殰y試和分析成千上萬個(gè)與靶抗原相關(guān)的細(xì)胞。通過減少實(shí)際操作時(shí)間并統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)化從多個(gè)流程中提取的數(shù)據(jù)，自動(dòng)化克隆篩選工作流程可以幫助克服這一困難。
這些工作流程最大限度地提高了目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，同時(shí)可以將自動(dòng)化儀器整合在一起�？偟膩碚f，這樣的工作流程具有成本效益，節(jié)省時(shí)間，并且易于根據(jù)不斷變化的研究目標(biāo)進(jìn)行更改。
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